串联标记的HMGB1融合蛋白表达载体的构建及其诱导表达与纯化

1 引言

2 材料与方法

2.1 质粒

2.2 主要试剂

2.3 pET-14b-SBP-HMGB1 重组质粒的构建

利用 PCR 技术以pET-14b-HMGB1-EGFP 为模板，扩增HMGB1 全长编码序列。使用的上游引物为5′CAT GGTACC GGC AAA GGA GAT CCT AAG AAG C 3′（下划线为Kpn I 位点）；下游引物为5′CCCG CTCGAG TTA TTC ATC ATC ATC ATC TTC TTC TTC 3′（下划线为Xho I 位点）。用高保真DNA 聚合酶KOD plus 进行聚合酶链反应（polymerase chainreaction，PCR）扩增（反应条件为94 ℃，15 s；56 ℃，30 s；68 ℃，1 min，35 个循环），扩增片段大小为645 bp。将PCR 产物和载体pET-14b-SBP-EGFP 分别用Kpn I 和Xho I 双酶切并电泳切胶回收后，用T4 DNA 连接酶连接，将连接反应混合物转化大肠杆菌株DH5α。

2.4 His-SBP-HMGB1 融合蛋白的原核表达及纯化

3 结果

3.1 pET-14b-SBP-HMGB1 重组质粒的鉴定

为了鉴定构建的重组质粒是否正确，将提取的质粒pET-14b-SBP-HMGB1 分别用Kpn I和Xho I 进行双酶切。电泳结果表明，经双酶切后可得到约4.8 kb 和645 bp 的片段，符合预期大小。而用特异性引物进行PCR 反应扩增后在600-700 bp 之间出现与预期相符的结果。测序结果（用T7 promoter primer 和T7 terminator primer 双向测通）证实插入到pET14b-SBP-EGFP 载体中的目的片段是正确的。

3.2 His-SBP-HMGB1 融合蛋白的诱导表达及纯化

4 讨论

HMGB1 作为一种细胞因子是一种重要的晚期炎症介质，也是一个重要的肿瘤调节基因，在多种人类肿瘤组织中过量表达。其生物学活性主要是通过与其相应受体的相互作用而实现，其中RAGE 是HMGB1 的主要受体，通过与HMGB1 高亲和力结合，参与免疫应答等生理、病理过程，如通过激活p38 MAPK，p44/p42 MAPK，SAPK/JNK 信号通路促进细胞的生长、分化成熟。Dumitriu 等报道树突状细胞通过释放HMGB1 作用于RAGE 受体控制T 细胞活化；用RAGE 中和抗体和RAGE 缺失的细胞，发现RAGE 是HMGB1 在树突状细胞发挥效应所必需的。Park 等报道，HMGB1 依赖Toll 样受体（Toll like receptor，TLR），包括TLR4 和TLR2，介导的信号通路来激活NF-κB。然而Kokkola 等等用TLR2 基因敲除小鼠研究发现HMGB1 激活的巨噬细胞分泌的TNF 并未受影响，所以，TLR 作为HMGB1的膜受体参与NF-κB 信号转导仍然存在一定的争议。

串联亲和纯化 (tandem afinity purification，TAP) 技术是近年来发展的一种能够快速研究生理条件下蛋白质相互作用、揭示蛋白质复合体相互作用网络的新技术。目前，TAP 技术已被应用到哺乳动物、酵母、细菌、果蝇和植物等多种生物的研究中。近年来，Stratagene公司开发出一套适用于哺乳动物细胞的TAP 系统（Interplay Mammalian TAP system），用于寻找哺乳类动物细胞内相互作用的蛋白质。该系统所使用的串联纯化标签（tandem tag）之一链酶亲和素结合肽（streptavidin-binding peptide），是从随机肽库中分离出的45 个氨基酸组成的多肽，可以与链酶亲和素树脂高亲和力结合，并能够用生物素（biotin）有效洗脱，该标签可高通量的纯化目的蛋白复合物，并且由研究报道，利用SBP-tag 纯化的蛋白要比His-tag 纯化得到的蛋白更纯。此技术可在接近生理条件下研究蛋白质之间相互作用。运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用，可快速得到与目的蛋白存在真实相互作用的高纯度的蛋白质。在研究蛋白质相互作用的方法学上获得了巨大的突破，为研究高等真核生物的蛋白质相互作用网络和蛋白质组学提供了新方法。

本研究中，我们利用分子生物学实验技术通过构建原核表达载体，将具有重要功能的HMGB1 偶联上两个串联亲和纯化标签His 和SBP，并在大肠杆菌中大量表达获得了该融合蛋白，为找出HMGB1 在细胞膜上的特异性受体，深入研究其作用于细胞的信号转导机制提供了重要的实验工具。

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